Cell|肠道细菌可将糖皮质激素转化为孕激素，影响孕妇情绪

2024-07-27 21:02:48怀孕

肠道细菌在人类健康和疾病中发挥重要作用，可直接影响宿主生理。同样的，类固醇激素可调节关键的生理健康，如新陈代谢和应激反应、性发育和生殖、盐和水平衡以及行为举止。有研究表明，肠道细菌组成、宿主表型和类固醇激素水平之间存在相关性。类固醇结构的微…

肠道细菌在人类健康和疾病中发挥重要作用，可直接影响宿主生理。同样的，类固醇激素可调节关键的生理健康，如新陈代谢和应激反应、性发育和生殖、盐和水平衡以及行为举止。有研究表明，肠道细菌组成、宿主表型和类固醇激素水平之间存在相关性。类固醇结构的微小变化会引起激素功能的巨大变化，肠道菌群可以通过水解、酯化、去羟基化、脱氢、芳香化和侧链裂解等方式引起类固醇的转化。但是肠道细菌是如何修饰类固醇以及产生的代谢物如何影响宿主健康尚不清楚，2024年6月6日一篇题为“Gut bacteria convert glucocorticoids into progestins in the presence of hydrogen gas”的研究论文发表在Cell杂志上，该研究表明，人类肠道细菌帕氏戈登氏杆菌（Gordonibacterpamelaeae）和迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）可将糖皮质激素转化为孕激素，并且人类肠道微生物产生的主要气体H2会大大促进该反应的发生。

研究方法

组学方法：类固醇激素靶向检测，宏基因组检测分析，比较基因组分析；

其他方法：扫描电子显微镜成像，粪便菌群转移(FMT)实验等。

研究结果

1. 人和鼠的微生物群21-去羟基化胆汁糖皮质激素3α5αTHDOC

为了研究21-去羟基化作用，研究人员开发了一种基于超高效液相色谱（UHPLC）串联质谱（MS/MS）质谱（UHPLC-MS/MS）的方法来量化复杂基质中的类固醇激素（糖皮质激素和孕激素）。与SPF（无特定病原菌）雌性小鼠相比，GF（无菌）雌性小鼠的粪便中THP（四氢孕酮）的总水平显著降低（图1A）。人类胆汁中3α5αTHDOC（四氢脱氧皮质酮）和3α5βTHDOC是丰富的胆汁皮质类固醇，并且其平均浓度高于3β5αTHDOC、3β5βTHDOC、11-脱氢皮质酮和皮质酮（图1B）。这些数据表明，肠道细菌暴露于生理相关浓度的3α5αTHDOC和3α5βTHDOC。据报道，3α5αTHDOC以微摩尔浓度存在于孕妇胆汁中（其浓度为12-52mM）。假设3α5αTHDOC可以被21-去羟基化生成3α5αTHP或脱氢皮质酮。或者可以通过3α-HSDH（类固醇脱氢酶）和3β-HSDH的连续作用在C3位置异构化为3β5αTHDOC。然后，该化合物可以被21-去羟基化以形成3β5αTHP。最后，两种THP异构体可以通过3α-HSDH和3β-HSDH的作用相互转化（图1C）。

为了检验肠道细菌是否可以将3α5αTHDOC转化为THP，研究人员在有3α5αTHDOC的情况下培养了来自怀孕GF和SPF小鼠的粪便，并用UHPLC-MS/MS靶向检测孕激素的水平。SPF怀孕小鼠粪便浆液中大量产生3α5αTHP和3β5αTHP，而来自GF怀孕小鼠的粪便浆液没有产生THP（图1D）。这些结果表明，来自雌性小鼠的微生物群执行21-去羟基化作用。接下来，测定了来自健康人类受试者的微生物群落的21-去羟基化活性吗，来自女性受试者的三种粪便培养物均产生了THP（图1E），来自男性粪便的四个微生物群落中的三个也可以21-去羟基化3α5αTHDOC（图1F）。这些结果表明，小鼠和人类肠道细菌都可以21-去羟基化3α5αTHDOC以产生孕激素。

研究人员对17名非孕妇和7名孕晚期孕妇的粪便进行了靶向类固醇检测分析。令人惊讶的是，第三孕期孕妇的粪便中THP水平比男性和非孕妇女性高两个数量级（图1G）。孕酮和孕烯醇酮也可检测到，但浓度要低得多。这些发现表明，孕妇粪便中THP水平很高。

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图1.类固醇激素靶向检测说明肠道微生物群和妊娠状态会影响胃肠道中的孕激素水平

2. 戈登氏杆菌（G. pamelaeae）和迟缓埃格特菌（E. lenta）21-去羟基化3α5αTHDOC

在现代遗传学出现之前进行的早期工作已经分离出一个21-去羟基化的分离株，命名为Eggerthella lenta（迟缓埃格特菌），测试了几种E. lenta（DSM 2243、DSM 15644、Valencia和A2）的21-去羟基化活性，但未观察到THP的形成。因此，研究人员试图从人类粪便微生物群落中分离并鉴定出21-去羟基化的物种，

精氨酸（Arg）刺激E. lenta和密切相关的生物体的生长。从未怀孕的女性供体(F3)的粪便中培养细菌，在Arg存在的情况下，3α5αTHDOC产生的THPs最多(图1E)。21-去羟基活性依赖于培养基中Arg的存在（图2A）。将培养物的连续稀释液接种到高Arg（1%）琼脂板上，菌落挑选未产生任何活性21-去羟基化菌。然而，通过将连续稀释板分成四个象限并培养得到的象限细菌池（图2B），来自10-5稀释板的一个象限池进行了21-去羟基化作用，将3α5αTHDOC转化为3α5αTHP，而其他三个象限池没有活性（图2C）。对四个象限的宏基因组测序和比较分析揭示了戈登氏杆菌（Gordonibacterpamelaeae）存在于活性培养池中但不存在于三个非活性培养池中的唯一细菌种类，它是E. lenta的近亲。由于G. pamelaeae在象限池中的丰度较低，因此没有尝试进一步的菌落挑选，而是使用了正交试验并获得了这种细菌的标准菌株G. pamelaeaeDSM 19738。这种细菌将3α5αTHDOC进行21-去羟基化作用，产生3α5αTHP和3β5αTHP，尽管水平较低（图2E）。将G. pamelaeaeDSM 19738与肠道共生菌E. coliNissle 1917（EcN）共培养会导致活性显著增加（图2E）。EcN本身无法进行21-去羟基化作用，这表明它并不是这种转化的原因。测试了包含26种菌株的人类肠道E. lenta和Gordonibacter物种在单独培养和与EcN共培养时的活性。尽管这些菌株在单独培养时均未表现出21-去羟基化作用，但12个菌株在与EcN共培养时产生了不同程度的THP（图2F）。其余14个菌株在共培养时未产生THP。这些结果表明，Eggerthellaceae家族成员能将3α5αTHDOC进行21-去羟基化作用，并暗示这种活性是由EcN诱导的。然而，在其他更复杂的微生物群落中，其他细菌也可能参与21-去羟基化作用。由于E. lenta中有遗传工具可用，而G. pamelaeae中则没有，因此研究人员使用E. lenta进行了后续的体外研究。

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图2.人类相关的Gordonibacter和Eggerthella菌株将3α5αTHDOC进行21-去羟基化反应

3. EcN产H2促进E. lenta21-去羟基化

首先测量了添加和未添加EcN的E. lenta14A菌株的氧化还原电位。与之前的报道类似，共培养体系的氧化还原电位比单一培养体系更为负。这种氧化还原电位的差异也与21-去羟基化活性相关，与之前的报道一致。虽然生长培养基的氧化还原电位与21-脱羟基化活性相关，但它并不使E. lenta14A菌株发生21-脱羟基化。将EcN 48小时单一培养产生的无菌上清液（经过真空过滤和注射器过滤）分别添加到E. lenta14A中。有趣的是，只有EcN注射器过滤的上清液在E. lenta中诱导了21-脱羟基化（图3D）。由于气体通过真空过滤被去除，而注射器过滤则不会，因此假设EcN产生了一种气体，导致迟缓埃希氏菌中发生21-脱羟基化。H2是人类肠道微生物产生的主要气体，在H2下培养了E. lenta14A，E. lenta14A单一培养显示出与E. lenta14A和EcN共培养相当的21-去羟基化活性（图3E）。相比之下，在N2下生长的E. lenta14A单一培养并没有表现出21-去羟基化活性。在H2条件下生长的EcN也没有进行21-去羟基化，进一步支持了E. lenta含有该反应所需酶机制的发现。这些结果表明，H2气体足以促进E. lenta中的21-去羟基化，且大肠杆菌产生H2是这种细菌促进E. lenta中强效21-去羟基化的主要驱动力。有趣的是，虽然E. lenta14A和EcN在单独培养时都能产生H2，但共培养产生的H2是单独培养的三倍（图3H）。在G. pamelaeae和EcN的共培养中也观察到了协同的H2产生（图3I和3J）。因此，共培养中产生的更高水平的H2可能促进了E. lenta中的21-去羟基化活性。捐献者F2的粪便培养在48小时内产生了H2，已证明这种水平可以促进共培养中的21-去羟基化并产生THPs（图3K和3L）。这些结果表明，与先前的文献一致，人类微生物群落可以成为H2的净产生者，并执行21-去羟基化。

除了EcN之外，革兰氏阳性菌株梭菌VPI 12780和产气荚膜梭菌ATCC 13124，以及革兰氏阴性菌株柠檬酸杆菌ATCC 8090和弗氏柠檬酸杆菌ICC 168，均能在E. lenta14A中诱导21-去羟基化（图3M）。这些结果表明，一系列革兰氏阴性和革兰氏阳性肠道细菌能够促进21-去羟基化。根据已公布的数据集，大多数诱导菌株都含有注释的氢化酶。对于缺乏注释氢化酶的菌株，鉴定出了氢化酶同源物。产生较少H2的细菌诱导的21-去羟基化也较少（图3M）。这些结果表明，21-去羟基化的细菌诱导剂具有产生H2气体的能力。

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图3.H2是诱导E. lenta加强21-去羟基化的必要条件

4.基因簇Elen_2451–Elen_2454负责21-去羟基化

比较基因组学分析发现所有15个产生菌都含有四基因簇Elen_2451–Elen_2454（图4A）。E. lenta中的21-去羟基化活性是依赖于钼的，并暗示钼蝶呤氧化还原酶（pfam: pf00384）可能是该基因簇中的主要酶单元。在E. lenta中同源表达其他假定的含钼蝶呤氧化还原酶基因簇（Elen_3048–3051和Elen_2917–2921）并未导致21-去羟基化活性增加（图4G）。在E. lenta的近亲、缺乏Elen 2451–2454同源物且不进行21-去羟基化的G. uro（G. urolithinfaciensDSM 27213）中诱导稳定结构（包含Elen_2451–2453）的表达会显著导致从THDOC中产生大量THP（图4I）。这些结果表明，Elen_2451–2453编码的蛋白质使非产生菌G. uro能够进行21-去羟基化。通过胰蛋白酶消化蛋白质组学确认Elen_2451–2454编码的蛋白质存在于21-去羟基化片段中。综上所述，Elen_2451–2454负责E. lenta中的21-去羟基化。

与未怀孕的人相比，怀孕者的胆汁中THDOCs的水平高出5到10倍。怀孕期间胆汁中THDOCs的较高水平不能完全解释粪便中THPs增加100倍的情况，这表明怀孕期间微生物组的转变可能有助于肠道中THP水平的增加。对怀孕和非怀孕女性粪便进行了宏基因组测序，孕妇粪便中的α（Shannon指数）多样性增加。孕妇和非孕粪便样本的微生物群落组成（β多样性）之间也观察到显著差异。差异属水平丰度的组成分析表明，Gordonibacter是孕妇捐献者样本中唯一显著富集的属，而Bacteroidetes门成员Bernardetia在非孕妇粪便中的丰度显著更高（图4J）。通过基于组装的分类特征分析确定的Eggerthella和Gordonibacter属的总水平在孕妇中显著高于非孕妇（图4K）。此外，Elen_2451-2454同源物的归一化基因丰度在孕妇粪便中显著更高（图4L）。THPs的浓度与Elen_2451-2454同源物的丰度呈正相关（图4M）。在孕晚期，含有Elen_2451-2454基因簇的细菌水平较高。这些结果表明，微生物组可能是导致孕晚期人群胃肠道中THP高水平的原因之一。

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图4.Elen_2451–2454基因簇编码钼依赖的21-去羟基化酶活性

5.怀孕供体的菌群移植（FMT）会导致体内THP的产生

对怀孕捐赠者P7的粪便微生物群进行移植（FMT），移植到无菌（GF）雌性小鼠体内（图5A）。第28天对盲肠内容物中的E. lenta进行定量检测，该微生物已成功定植。受体小鼠在第10、16和28天的粪便中THP水平显著升高，表明随着时间的推移，持续产生THP，且E. lenta定植稳定（图5B）。这些结果表明，来自怀孕个体的微生物组足以在肠道中产生THP。将GF雌性小鼠与E. lenta14A和EcN共同定植（图5C）。7天后，共定植小鼠的粪便中THP含量显著高于GF对照组（图5D），这表明当与EcN共同定植时，E. lenta14A在体内21-去羟基化宿主产生的THDOC。将GF小鼠与E. lenta14A（含有基因簇的菌株）和EcN或者E. lentaA2（缺乏基因簇的菌株）和EcN共同定植（图5E）。前者小鼠粪便中总THP和3α5βTHP的水平显著升高（图5F和5G）。这些数据进一步支持了Elen_2451–2454基因簇负责21-去羟基化活性的假设。